人Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體B(MHCB)ELISA試劑盒使用說明書

【資料簡介】

人Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體B(MHCB)ELISA試劑盒

產(chǎn)品僅供教研使用，用于定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中人MHCB。                                  

使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說明書。僅供科研使用，不能于臨床診斷或治療。

簡介

Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體（MHC I類）是一種細(xì)胞表面糖蛋白，由跨膜重鏈（α鏈）和輕鏈（β2m微球蛋白）組成，通過非共價鍵結(jié)合形成二聚體， MHC I類分子在幾乎所有有核細(xì)胞及血小板表面表達(dá)，其主要功能是遞呈內(nèi)源性抗原肽，供CD8+ T細(xì)胞識別，從而參與免疫監(jiān)視和對病毒感染或腫瘤細(xì)胞的清除。

檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測物MHCB，清洗后，再加入標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中MHCB的濃度。

檢測實驗的局限性

本試劑盒僅供科研使用，不能用于臨床診斷或治療。

試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。

如果樣品產(chǎn)生的值高于標(biāo)準(zhǔn)，則用測定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測定。稀釋劑、實驗員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)果變化。

樣本采集、處理和存儲的變化可能會導(dǎo)致樣本值的差異。

本試劑盒實驗設(shè)計消除了不同生物樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。

操作要點及注意事項

1. 混合蛋白質(zhì)溶液時，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨使用容器。

2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。

3. 當(dāng)使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。

4. 顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無色變?yōu)樗{(lán)色。

5. 應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。

6. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。

7. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

8. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

9. 佩戴防護(hù)手套、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后洗手。

試劑盒組成及儲存條件

需要的其他材料

1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。

樣品處理及要求

下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評估。

細(xì)胞培養(yǎng)上清液：

在1000×g下離心15分鐘去除顆粒，立即進(jìn)行測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品建議預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)）

血 清：

使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘，然后在1000×g下離心15分鐘。立即取出血清并進(jìn)行測定或等分裝樣品，將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血清樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）

血 漿：

使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后30分鐘內(nèi)，以1000×g離心15分鐘。立即測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血漿樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）

注：檸檬酸鹽抗凝劑血漿未經(jīng)驗證可用于本試驗，使用時應(yīng)自行驗證可行性。溶血的樣品不適合用于該測定。

組織勻漿：

用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響檢測結(jié)果），稱重后將碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。

細(xì)胞裂解液：

貼壁細(xì)胞用預(yù)冷PBS輕輕清洗，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗3次，每1×106個細(xì)胞中加入150-200μL的PBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當(dāng)減少PBS體積）并通過反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。

其它樣本類型：

1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

樣品外觀：

樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

樣品保存 ：

樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

試劑準(zhǔn)備工作

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

洗滌液/稀釋液配置

如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

標(biāo)準(zhǔn)品配置

試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個試管，先從200ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至10ng/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的10ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為: 10ng/mL、 5ng/mL、 2.5ng/mL、 1.25ng/mL、 0.625ng/mL、 0.313ng/mL、 0.157ng/mL，從濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/mL)。

備 注：如待測樣本中MHCB濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的高值，請根據(jù)實際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。

實驗步驟

所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測

1. 酶標(biāo)板準(zhǔn)備：確定試驗所需要的孔數(shù)，取下未使用的酶標(biāo)條放回裝有干燥劑的鋁箔袋。

2. 樣本孵育：每孔分別加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以及預(yù)處理過的待測樣品（建議樣本用通用稀釋液最少稀釋1倍上樣，目的是減少基質(zhì)效應(yīng)），蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)1 h。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。

3. 抗體孵育：每孔加入100μL抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)1h。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟2中的清洗方式清洗4次。

4. 酶標(biāo)孵育：每孔加入100μL 1×SA-HRP工作液，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)30分鐘，清洗4次，拍干。

5. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

6. 終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液，輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。

重復(fù)性

板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.08ng/mL。

線性關(guān)系

分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度MHCB，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評估線性。

特異性

該試劑盒測定可識別重組人MHCB。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。