單克隆抗體制備技術(shù)方法

【資料簡(jiǎn)介】

一、單克隆抗體的產(chǎn)生 
    經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)(除及時(shí)凍存的細(xì)胞外)。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。 
    大量制備單克隆抗體的方法有兩類：一類是動(dòng)物體內(nèi)誘生法，另一類是體外培養(yǎng)法。 
    (一).動(dòng)物體內(nèi)誘生法
　　接種動(dòng)物常選用BALB/c小鼠或與BALB/c小鼠雜交的Fl代小鼠。接種前l(fā)周左右，于小鼠腹腔內(nèi)注入降植烷或醫(yī)用液狀石蠟0.5ml。每次小鼠腹腔注射0.5×10⁶～1×10⁶個(gè)雜交瘤細(xì)胞。接種后7～10天，小鼠腹部逐漸長(zhǎng)大，誘生出腹腔腫瘤并產(chǎn)生含單克隆抗體的腹腔積液。接種后10～14天，可分次采集腹腔積液，1只可得10～20ml(5～20mg/m1)。收集到的腹腔積液，離心去除細(xì)胞，滅活(56℃、30min)，再次離心，取上清液，加入0.1%疊氮鈉，分裝保存于-20℃。如凍干保存，抗體效價(jià)可保持更久。 
    (二).體外培養(yǎng)法 
    將雜交瘤細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，在5%C02，37℃孵箱中培養(yǎng)數(shù)天后，收集上清液，離心去除細(xì)胞和碎片。本法所得抗體含量不高，為5～25pg/ml。但仍可滿足部分實(shí)驗(yàn)的要求。另一種是雜交瘤細(xì)胞高密度培養(yǎng)，分兩種類型：一類是懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，即采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式的生物反應(yīng)器；另一類是細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，包括中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。高密度培養(yǎng)可使單位體積單克隆抗體含量明顯增加，產(chǎn)量可達(dá)lg/L。 
    二、單克隆抗體的純化 
    從培養(yǎng)液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應(yīng)用于日常診斷或定性研究。由于其中含有大量來(lái)自培養(yǎng)基、宿主或克隆細(xì)胞本身的一些無(wú)關(guān)蛋白，如果用于免疫標(biāo)記測(cè)定，如放射性核素、酶、熒光素或*標(biāo)記等，必須進(jìn)一步分離和純化。無(wú)論培養(yǎng)液、腹腔積液或血清，均可先用半飽和、飽和硫酸銨進(jìn)行沉淀，達(dá)到初步濃縮和純化的目的。經(jīng)過(guò)適當(dāng)溶解和充分稀釋后，可用親和層析法進(jìn)一步純化。 
    三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 
    當(dāng)獲得多個(gè)雜交瘤細(xì)胞株時(shí)，要了解哪一株是zui適用的，則一定要通過(guò)各種鑒定。常見(jiàn)的方法有：
    (一)Ig類型測(cè)定 
    通常以免抗小鼠Ig類及亞類抗體與培養(yǎng)液中單克隆抗體按雙向瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定，確定其Ig類型或Ig亞類型別。 
    (二)特異性測(cè)定 
    把與相應(yīng)抗原有關(guān)的物質(zhì)同McAb進(jìn)行多種免疫學(xué)檢測(cè)，鑒定McAb的特異性。這直接關(guān)系到McAb應(yīng)用的可靠性。 
    (三)抗體效價(jià)測(cè)定 
    效價(jià)以腹腔積液或培養(yǎng)液的稀釋度表示，稀釋度越高，則抗體效價(jià)也越高。在凝集反應(yīng)中，腹腔積液效價(jià)可達(dá)5萬(wàn)以上；在ELISA中，腹腔積液效價(jià)可達(dá)100萬(wàn)以上。如ELISA效價(jià)低于10萬(wàn)，用于診斷測(cè)定將不會(huì)達(dá)到很高的敏感度，應(yīng)重新制備。 
    (四)表位測(cè)定 
    通過(guò)雙向瓊脂擴(kuò)散法，把兩種McAb混合，加入于同一孔中，對(duì)孔放相應(yīng)的抗原，如出現(xiàn)兩條沉淀線可證明兩者為抗不同表位的McAb；利用ELISA雙抗夾心法，將一種McAb作包被抗體，另一作酶標(biāo)記，其中加入抗原，如顯色，則證明兩者抗不同的表位。 
    (五)親和力測(cè)定 
    只有當(dāng)抗原與抗體結(jié)合部位結(jié)構(gòu)*吻合時(shí)，抗體的親和力zui大。這種結(jié)合力以抗原抗體反應(yīng)平衡時(shí)，抗原與抗體濃度的乘積與抗原抗體復(fù)合物濃度之比表示。如親和力太低，會(huì)嚴(yán)重影響測(cè)定的敏感性。 
    (六)染色體分析 
    正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒；小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體：SP2/0細(xì)胞為62～68，NS-1為54～64。大多數(shù)為非整倍性，有中部和亞中部著絲點(diǎn)。雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目接近兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外．還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細(xì)胞分泌價(jià)的抗體。