*�；�探針的制備實(shí)驗(yàn)

【資料簡介】

*酰化探針的制備實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)材料    DNA
試劑、試劑盒    DNA聚合酶dNTP2-疏基乙醇*甘油NaClEDTASDS無水乙醇
儀器、耗材    注射器電泳儀離心機(jī)培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  混合以下物質(zhì)于100 μl 反應(yīng)體積：

（1）10 μl  10×大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ緩沖液

（2）10 μl  0.5 mmol/l 3dNTP混合液

（3）10 μl  0.5 mmol/l *-11-dNTP貯存液

（4）10 μl  0.5 mmol/l 2-ME

（5）2 μg  DNA

（6）20 U  大腸桿菌聚合酶Ⅰ

（7）DNA酶Ⅰ貯存液，用錢用冷水稀釋1000倍

（8）加水到100 μl，15℃溫育2~2.5 h。

2.  取6 μl 反應(yīng)液，煮沸3 min 置于冰浴2 min。
 
3.  加樣于瓊脂糖凝膠，同時(shí)帶對照分子量標(biāo)準(zhǔn)，在15 V/cm 電壓降下電泳。
 
4.  消化的DNA大小介于100~500 bp 之間，接步驟5繼續(xù)，若大小在500~1 000核苷酸之間（或更大）加入第二份DNA酶Ⅰ繼續(xù)溫育。
 
5.  加入2 μl，0.5 mol/l pH8.0的EDTA和1 μl 10%SDS，68℃加熱10 min 終止反應(yīng)和滅活DNA酶Ⅰ。
 
6.  在1 ml 注射器中準(zhǔn)備如Sephadex G-50離心柱，用2 ml 無水乙醇清洗注射器和硅化的玻璃棉。

7.  接著用4ml H2O沖洗，將G-50介質(zhì)裝入注射器至刻度，用100 μl SDS柱緩沖液冼3~4次，上樣。

8.  分離*�；�的探針。探針濃度應(yīng)約為20 ng/μl ，探針可直接使用，也可在-20℃保存數(shù)年而不喪失活性。
 
9.  用比色法估計(jì)*�；�反應(yīng)的程度和探針的質(zhì)量或進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。

隨即寡核苷酸引物合成法

實(shí)驗(yàn)材料    DNA
試劑、試劑盒    dNTP*klenow酶TEEDTALiCl乙醇
儀器、耗材    離心機(jī)培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  在1. 5 ml 離心管中加入500 ng~2 μg 模板DNA，加水至總體積為34 μl。
 
2.  在沸水中變性DNA 5 min 置于冰浴5 min，稍加旋離。

3.  按順序加入下列溶液：

（1）10 μl  *�；�隨即多聚體

（2）5 μl  dNTP/*混合物

（3）1 μl  klenow酶（5U）

（4）37℃溫育1 h。
 
4.  加入3 μl 0.5 mol/l EDTA pH8.0以終止反應(yīng)。加入5 μl 4 mol/l LiCl和150 μl 冰冷的無水乙醇，置于冰浴30 min。

5.  室溫高速離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌。
 
6.  DNA用20 μl pH7.5的TE緩沖液重懸。用比色法或化學(xué)發(fā)光法估價(jià)*�；�反應(yīng)的效果。