多藥抗藥基因的表達(dá)實驗

【資料簡介】

實驗方法原理    大多MDR細(xì)胞膜上出現(xiàn)MDR-1基因及其基因產(chǎn)物P-糖蛋白過度表達(dá)。
實驗材料    RNA
試劑、試劑盒    PBS氯仿異丙醇萘酸異硫氰酸肽十二烷基肌酸鈉構(gòu)櫞酸鈉乙酸鈉二疏基乙醇乙醇Taq酶
儀器、耗材    離心機(jī)紫外分光光度計瓊脂糖凝膠電泳PCR儀
實驗步驟    
一、細(xì)胞總RNA提取 

1.  收集約5×107個細(xì)胞，冷PBS洗滌。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉，0.025 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉pH7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混勻。

3.  加入400 ul 氯仿，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min。

4.  取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 離心15 min，吸上清，將RNA成點用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中。

6.  并用紫外分光光度計檢測RNA純度（A260/A280應(yīng)為1.8~2.0）后備用。

二、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增 

1.  引物

2.  取細(xì)胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中，42℃保溫30 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

3.  然后置95℃，3 min 終止反轉(zhuǎn)錄。

4.  接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β2-MG引物，對cDNA上的目的片段進(jìn)行PCR

5.  94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個循環(huán)。

6.  zui終在60℃保溫7 min，以保證產(chǎn)物充分延伸。

7.  取10 ul 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cDNA陽性對照，等位的DNA條帶為陽性，反之為陰性。