鹽酸克倫特羅ELISA檢測(cè)說(shuō)明

【資料簡(jiǎn)介】

鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑盒

使用說(shuō)明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)尿樣、組織、飼料等樣本中的鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLE），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的鹽酸克倫特羅和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗鹽酸克倫特羅抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含鹽酸克倫特羅含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中鹽酸克倫特羅的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測(cè)下限：

尿液……………………………0.05ppb

組 織（處理法一）……………0.2ppb

組 織（處理法二）……………0.05ppb

飼料……………………………0.5ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

克倫特羅………………………100%

特普他林………………………<1%

馬布特羅………………………<1%

溴布特羅………………………<1%

沙丁胺醇………………………<1%

萊克多巴胺……………………<1%

 2.5 樣本回收率：

尿樣……………………………95%±10%

組織、飼料……………………85%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

10X復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml

說(shuō)明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0μl-200μl，100μl-1000μl、多道300μl

4.3 試劑：*、乙酸乙酯、濃HCl、乙腈、甲醇、正己烷、無(wú)水*

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.1M HCl 溶液

    取0.86ml濃HCl加去離子水至100ml。

配液2：0.1M NaOH 溶液

    稱取0.4g NaOH加去離子水至100ml。

配液3：乙腈-0.1M HCl 溶液

    V乙腈:V0.1M HCl =84:16。

配液4：復(fù)溶液

    將10×復(fù)溶液用去離子水10倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 尿樣處理方法：

    直接取50μl清亮尿樣進(jìn)行測(cè)定（渾濁尿樣需要過(guò)濾或經(jīng)4000r/min離心5min，以得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

尿樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.05ppb

5.3.2 組織樣本處理方法一：

   稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml復(fù)溶液，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取50μl上清液進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測(cè)下限：0.2ppb

5.3.3 組織樣本處理方法二：

1）稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml乙腈-0.1M HCl，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min。

2）取上清液3ml，加入2ml 0.1M NaOH，加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min，取全部上清在50-60℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；

3）加入1ml 復(fù)溶液混合振蕩30s，取50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.05ppb

5.3.4 飼料樣本處理方法：

1）稱取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g，加入10ml甲醇，再加入5g無(wú)水*，振蕩2min，室溫 4000r/min以上離心10min；

2）吸出離心后的上清液1ml，于50-60℃氮?dú)饣蚩諝饬鞔蹈桑? ml復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，再加入1mL正己烷混合30s；室溫4000r/min以上離心5min。

3）取50μl下層進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測(cè)下限：0.5ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實(shí)驗(yàn)開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入50μl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250μl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50μl，再加底物液B 50μl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?/span>

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。